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ｐDEST-MyGene プラスミドの作成原理図　プロモーター付加遺伝子の作成原理

attB付加PCRとBP反応によりプロモーターをｐENTRベクターにクローニングするプロトコール

新たなプロモーターをpENTRベクターに載せる方法には２種類が考えられます。

方法１）プロモーター断片を持つプラスミドから制限酵素で切り出したプロモーターや、ゲノムからPCRで増幅したプロモーターをライゲーションによりクローニングする方法。pENTR1A（インビトロジェンHP）などのベクターのattL1とattL2の間に、multiple cloning siteを利用して挿入します。

方法２）プロモーターをPCRで増幅する際に、5'端にattB1およびattB2配列を付加したプライマーで増幅します。増幅された断片の両端をBP Clonaseでベクター上のattP1, attP2配列と組み替えることによりpDONR201（インビトロジェンHP）などのベクターに挿入します。